小G蛋白RhoA活性检测方法的优化
- 1. 复旦大学 生命科学学院 遗传工程国家重点实验室， 上海 200032； 2. 复旦大学 基础医学院代谢与分子医学教育部重点实验室， 上海 200000
Optimization of the method for measurement of the activity of small GTP binding protein RhoA
- 1. Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Science, Fudan University, Shanghai 200032;
2. Key Laboratory of Metabolism and Molecular Medicine, Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200000, China
摘要： Rho蛋白家族的小G蛋白是调节细胞迁移的关键蛋白，具有GTP酶活性。RhoA是该蛋白家族的重要成员，通过其催化活性来调节肌动蛋白的聚集和收缩，在肿瘤迁移和侵袭中发挥重要作用。所以，RhoA的GTP酶活性检测对于研究细胞迁移的机制，以及靶向RhoA的治疗策略具有重要意义。RhoA下游效应子Rhotekin基因（RhoA effector）具有RhoA结合结构域（RhoA binding domain, RBD）,该RBD蛋白结构域能与活化状态的GTP-RhoA特异结合。通常用外源表达的RBD蛋白pulldown结合GTP-RhoA的蛋白量，作为RhoA活性检测方法。但是，哺乳动物来源的RBD蛋白在原核细胞中的表达量很低，使得pulldown结合GTP-RhoA蛋白量的效率低下，从而不利于RhoA的活性检测。因此，目的在于提高RBD蛋白在大肠杆菌中的产量，提高RBD蛋白pulldown结合GTP-RhoA的效率，从而优化RhoA活性检测方法。通过密码子优化技术对RBD基因进行改良，提高其蛋白在大肠杆菌中的表达量，优化RBD蛋白pulldown实验检测GTP-RhoA的效率。优化后的RBD与GST标签蛋白融合后在大肠杆菌中高效表达，并且能够特异性地与GTP-RhoA结合。成功地构建了具有较高表达水平的GST-RBD载体，并优化了传统的GST-RBD pulldown检测体系，为进一步深入研究RhoA在细胞迁移中的功能提供了一种有效的技术手段。