摘要: 来自于酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶,由于分子量较大,在大肠杆菌中难以实现高效分泌表达。为研究其在E. coli中高效分泌表达策略,构建了带信号肽的pET-28a(+)-pelB-pul13A质粒,通过发酵过程控制及向发酵培养基中添加促分泌物质,系统地优化了分泌表达策略。通过分子改造,带信号肽的表达系统实现了低水平的分泌性表达;进一步通过优化培养基、诱导温度、IPTG浓度、诱导时机及11种培养基添加物,促进普鲁兰酶最大限度的分泌到周质空间。实验结果显示,连上pelB信号肽的pull3A在TB/SB培养基中,通过优化的诱导条件(IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导温度20℃,诱导时机为接种后5 h),在诱导20 h时加入0.03%SDS,周质空间酶活达到最大值102.5 U/mL。在此基础上,探究了化学添加剂对大肠杆菌细胞膜及膜通透性的影响,并应用优化后的系统实现了乙酰胆碱酯酶和单域抗体的分泌表达。为大分子蛋白在大肠杆菌中分泌表达提供参考。